【摘要】目的探讨臭氧水对牙周可疑致病菌伴放线放线杆菌（Aa）的灭活效果。方法采用悬液定量杀菌方法和和化学方法在实验室进行观察。用4、8、15 mg／L的臭氧水分别对悬液中Aa作用1、2、3min。结果当臭氧水浓度为4mg／L对悬液中Aa没有杀灭作用。当臭氧水浓度为8 mg／L 时，对悬液中Aa作用1min，杀灭率为57％，当浓度上升至15 mg／L 时，对悬液中Aa作用1min，杀灭率上升至98％，而延长杀菌时间至3min，杀菌率维持在97％～99％。结论在25℃的室温条件下，臭氧水浓度达到15 mg／L，臭氧水温控制在15℃～18℃时对悬液中Aa 有快速、有效的杀灭作用。
【关键词】臭氧水；伴放线放线杆菌；杀菌作用
牙周病是由菌斑微生物引起的感染性疾病。普遍认为菌斑微生物构成的牙菌斑是引发牙周病的始动因子，是造成牙周组织破坏的主要因素。伴放线放线杆菌（Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa）是已知重要的牙周病可疑致病菌，它与侵袭性牙周炎的发生发展密切相关，且在慢性牙周炎的龈下菌斑中也常有检出。因此在牙周炎的治疗中需要使用机械方法去除菌斑并配合应用局部药物，辅以杀灭器械难以到达的感染深处和已侵入牙周组织内的细菌，从病原因子的层面阻断牙周病的发生和发展。臭氧（Ozone，分子式为O3）是一种活性氧，常温常压下可自行分解为稳态氧气（O2）与新生态氧原子（O）。研究发现，臭氧是一种广谱、高效的抗菌剂，与其它抗菌药物相比具有灭活细菌时间更短、尤其对厌氧菌灭活效果好的特点，因而有良好的应用前景。臭氧在口腔内使用的文献报道已有不少，但尚未见臭氧对牙周致病菌杀菌作用的实验研究报道。本研究用臭氧水对Aa进行了灭活试验，旨在为探索牙周炎药物治疗的新方法提供参考。
材料和方法
一、材料
1. 伴放线放线杆菌Y4：以下简称Aa，由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔微生物实验室馈赠。
2. 厌氧手套箱：Bugbox，英国。
3. CDC 培养基：厌氧血琼脂培养基，浙江省军区卫生防疫检验所生产。
4. 牛心脑浸出液（brain heart infusion，BHI）培养基：Becton，Dickinson and company，法国。
二、方法
1. 臭氧水制备和浓度测定：（1）臭氧水制备和臭氧含量测定：用上海康福特环境科技有限公司生产的臭氧水生成器制备臭氧水，依照我国建设部发布的《臭氧发生器臭氧浓度、产量、电耗的测量》标准CJ／T3028.2-94 中规定的碘量法测定臭氧浓度。量取20％碘化钾溶液10ml，倒入500ml的吸收瓶中，待臭氧发生器运行稳定后，用250 ml量筒取臭氧水250ml，倒入吸收瓶中，立即加入5 ml的（1＋5）硫酸溶液（使pH降至2.0以下）摇匀，静置5 min，用0.01mol／L 硫代硫酸钠标准溶液滴定，待溶液呈浅黄色时加入1％淀粉溶液约1ml，继续迅速滴定到颜色消失为止。记录硫代硫酸钠标准溶液用量，并做空白校正，采用公式Co3＝Ana×B×24.00×1000／V0计算出臭氧含量。Co3为臭氧浓度；Ana 为硫代硫酸钠标准溶液用量；B 为硫代硫酸钠标准溶液浓度，即0.01 mol／L；V0为臭氧水取样体积，即250ml。（2）臭氧水稳定性观察：臭氧机工作稳定后，将水温控制在10℃、15℃、20℃制备臭氧水，并在室温25℃的条件下放置不同时间，取样用上述方法测定臭氧浓度。
2. Aa悬液定量杀菌实验：（1）Aa菌悬液的制备：取冻干Aa（Y4）菌种，在无菌操作下融冻，以毛细吸管加入适量BHI 培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取50μl菌种悬液，划线接种于CDC厌氧血琼脂培养基平板上，于厌氧手套箱37℃厌氧培养72h。挑取上述第1代培养物中典型菌落，用接种环划线接种于CDC厌氧血琼脂培养基平板上。重复以上步骤，取第3～14 代培养物，接种于BHI培养基，并置于厌氧手套箱中37℃厌氧培养48 h，初步制成Aa菌悬液。用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至1×108cfu／ml。（2）中和剂鉴定实验：根据卫生部《消毒技术规范2002 年版》中2.1.1.10.5 的技术规范设计实验，评估中和剂、消毒剂和中和产物的细胞毒性，以平板上长出的菌落数评估对Aa 灭活作用。实验证明，所用中和剂和中和产物对Aa 存活和生长均无影响，而臭氧水对Aa有抑制和杀灭作用。在此基础上，按《消毒技术规范2002 年版》规定，设计6组实验。（3）不同浓度臭氧水对Aa 悬液定量杀菌实验：实验时，将4、8、15 mg／L 的臭氧水4ml 加入含0.5ml牛血清白蛋白（浓度为30 g／L）和0.5mlAa菌悬液（浓度为1×108 cfu／ml）中，分别作用1、2、3 min，同时用稀释液代替臭氧水进行平行实验做阳性对照。所有样本置于厌氧手套箱中37℃厌氧培养72 h，观察最终结果，计算杀灭率，实验重复3次，取平均值。
结 果
一、臭氧水温度对其稳定性的影响
经检测，水温越低，臭氧水中臭氧浓度下降速度越慢。当水温从10℃升至20℃时，臭氧水的半衰期从35min下降至15min，见表1。
二、中和剂鉴定实验结果
实验发现以含5g／L 硫代硫酸钠加含体积分数10％的小牛血清（浓度30g／L）的磷酸盐缓冲液（0.03 mol／L，pH7.2）能有效中和含量为15 mg／L 臭氧水对Aa 的残留作用，并对Aa无毒性作用，见表2。
三、不同浓度的臭氧水对Aa 进行悬液定量杀菌实验结果
臭氧水浓度为15 mg／L， 水温为17℃对悬液内Aa作用1 min，Aa 杀灭率可达98.39％，延长杀菌时间至3 min，杀灭率没有明显变化。而当臭氧水温在10℃时，同样浓度的臭氧水对悬液中Aa 几乎没有杀灭作用，见表3。
当臭氧水中臭氧含量下降至8 mg／L 时，对悬液内Aa 作用1 min，Aa 杀灭率下降至57.04％，延长杀菌时间至3min，杀灭率反而略有下降。臭氧水中臭氧含量进一步下降至4 mg／L 时对悬液内Aa 没有杀灭作用，见表4。
讨 论
本实验参照卫生部《消毒技术规范2002 年版》规定的方法和操作步骤执行。通过中和剂初选实验证明中和剂对Aa 存活和生长均无影响后进一步做中和剂正式实验。正式实验中第3、4、5 组的菌落数接近，第1、2 组都仅有少数菌落生长，说明所选中和剂符合判定要求。
臭氧在适宜浓度下可作为广谱杀菌剂使用已被许多实验证实。臭氧水的杀菌效果受多种因素的影响，如臭氧水浓度、环境温度、有机物等。考虑到有可能将实验结果进一步应用于临床治疗实验中，故将环境温度设定为25℃并在此基础上测定臭氧水各浓度对Aa 的灭活作用。本实验结果显示在室温条件下（25℃），8 ～ 15 mg／L 的臭氧水对悬液中的Aa有杀灭作用，其作用强度随臭氧浓度的升高而提高。目前普遍认为臭氧的杀菌机理是：（1）臭氧很容易同细菌细胞膜中不饱和脂肪酸结合，通过打断分离C ＝ G键氧化破坏细胞膜，穿入菌体内部，作用于脂蛋白和脂多糖，改变细胞的通透性，使细胞内物质外流，从而导致细菌溶解和死亡。（2）臭氧破坏和分解细胞膜后，迅速扩散进入细胞内，氧化细胞内的酶或RNA、DNA，从而杀死菌原体。臭氧水氧化反应有两种，微生物菌体既与溶解水中的臭氧直接反应，又与臭氧分解生成之羟基（OH）间接反应。由于羟基为强氧化剂，因此臭氧水的杀菌速度极快。这一点在本实验中亦可以看到。8 ～ 15 mg／L 的臭氧水对Aa 作用1 min即已取得杀菌效果，但作用时间从1 min 延长至3 min，对Aa 的灭活作用并没有提高。国内还有其它实验得出类似结论，臭氧水对微需氧菌的杀灭作用较金葡菌、大肠杆菌等兼性厌氧菌更加快速、有效。本实验发现灭活Aa 所需的臭氧水浓度相对国内其他类似实验所用浓度要高，这可能是在细菌悬液中添加了牛血清白蛋白（浓度为30 g／L）的缘故。这些牛血清白蛋白相当于10％体积的有机物。有机物对臭氧水杀菌作用的负面影响已被先前的实验研究证实。因为牛血清白蛋白能保护细菌，同时加速了臭氧的分解，使臭氧的杀菌力下降。添加有机物的目的一方面是遵照卫生部《消毒技术规范2002 年版》规定进行实验，另一方面菌斑附着的龈上、龈下组织和龈沟液内都存在有机物，这样做可以为进一步的临床实验提供更有益参考。此外，实验中还发现臭氧水温是影响臭氧水发挥杀菌作用的重要因素。当水温高于18℃时会导致臭氧快速分解而使其杀菌作用很快下降。而水温仅为10℃时，即使测得臭氧浓度很高，也很难发挥其杀菌作用。这些影响臭氧杀菌效果的因素在既往的文献中也有报道。
本实验就臭氧水对致牙周炎可疑细菌Aa 的杀灭效果做了初步分析，实验表明在适宜浓度与温度条件下，臭氧对Aa 的杀菌效果是肯定的。如取新鲜制备的臭氧水做牙周冲洗，利用臭氧快速杀灭牙周致病菌的特性而达到减轻牙周炎症的目的可能是一个可行且值得尝试的治疗方法。但臭氧水对动物实验性牙周炎及人类牙周炎治疗的效果尚有待进一步的研究与探讨。
来源：《中华口腔医学研究杂志》