摘要：为了探索绿色、无残留、无污染的土壤消毒新方法，研究了微/纳米气泡臭氧水的性质及其对尖孢镰刀菌的杀灭效果。将尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici）配成孢子浓度为2.4×104个·mL-1 的菌液后，通入微/纳米气泡臭氧水，对病原菌进行灭菌试验，研究灭菌效果及规律。在此基础上，将培养的尖孢镰刀菌均匀喷洒在营养土中，每7d 浇灌1 次微/纳米气泡臭氧水灭菌，连续浇灌3次，以自来水为对照。试验结果表明：当水中臭氧浓度为7.3mg.L-1、接触时间2min时，对孢子浓度为2.4×104 个.mL-1 的尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌的杀灭率接近100%；采用浓度为1.2~1.7 mg.L-1 和7.8~8.3 mg.L-1的微/纳米气泡臭氧水，对营养土进行3次连续灭菌后，对尖孢镰刀菌的最终杀灭率分别为76.83%和88.76%。由此可见，利用微/纳米气泡臭氧水对土传病害中的典型致病菌-尖孢镰刀菌具有一定的杀灭效果，可作为土壤消毒的一种新方法。
关键词：微/纳米气泡臭氧水；尖孢镰刀菌；杀灭率；土壤消毒
土壤消毒能有效杀灭土壤中的真菌、细菌、线虫、土传病毒以及地下害虫等，可以很好地解决高附加值作物种植中的重荐问题，并显著提高作物的产量和质量。目前的土壤消毒技术主要有物理、化学和生物熏蒸消毒等。物理消毒主要包括太阳能消毒、蒸汽消毒等。化学消毒是指将氯化苦、威百亩、棉隆、碘甲烷和福尔马林等熏蒸剂注入到土壤中进行消毒。生物熏蒸消毒是利用有毒气体杀死土壤中的害虫和病菌。但以上消毒方法存在受环境影响大、操作繁琐、能耗多等缺点；另外，很多化学消毒技术污染环境，残留问题严重，对人类健康和自然生态环境造成危害。因此，在实际生产中的推广应用受到限制。
由致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染而引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，可引起100 多种植物维管束萎蔫死亡，并且在植株的全生育期中都可发生，一旦侵染，蔓延很快，导致作物大面积减产而造成巨大经济损失，中国各栽培区均有发生且呈蔓延趋势。其侵染过程的动态性，种群的多样性（120 多个专化型及小种）及其相互间相干性，种内菌株形态、生理、病理等多变性与复杂性，遗传的多态性等因素造成侵染机制研究的复杂性及难度，成为当前发展新型防治技术的一个瓶颈，新的广谱性灭菌方式有待开发。目前研究较多的是施用杀菌剂、有益微生物对病原菌产孢量的抑制作用，以及植物提取物和根系分泌物对病原菌产孢量的影响，却忽略了物理灭菌这一简单高效的方式。
臭氧是一种氧化性极强、功能多样化、极具开发价值的气体，其杀菌作用快速、广谱，属于高效消毒剂，而且无论在气体状态，还是溶于水的状态，都极易分解为氧气，不会对环境造成二次污染，因此臭氧被称为“理想的绿色灭菌剂”，广泛应用于水处理、空气消毒、医疗保健、果蔬保鲜、水产养殖等领域。臭氧应用于农业生产的研究，是随着封闭式无土栽培的发展在20世纪80年代末开始的，目前已有研究表明：采用臭氧进行营养液消毒、设施病害防治、基质和土壤消毒等效果显著。RUNIA等将臭氧通入无土栽培灌溉后回收的营养液中，以杀灭营养液中植物根传病菌，实现营养液的重复利用。在荷兰、法国等国家，臭氧已经应用于生产中营养液的消毒。喻景权等用10L·min-1的臭氧对含有番茄青枯病病原菌和番茄枯萎病病原菌的营养液进行曝气，发现曝气90min后青枯病病原菌完全被杀灭，曝气120min后枯萎病病原菌孢子全部死亡。
微/纳米气泡是指直径≤50μm 的微小气泡，具有自增压、带负电荷和强氧化性的自由基等特性，农业行业和食品科学技术领域对微/纳米气泡技术的应用日益重视。与普通微小气泡相比，微/纳米气泡在水中上升缓慢，能够在水中停留更长的时间，并且微/纳米气泡会自我压缩，溶解于水中。因此，在水中具有很高的溶解度。基于此，本研究应用微/纳米气泡发生装置制备臭氧水对致病性尖孢镰刀菌进行杀灭研究，测试试验条件下微/纳米气泡臭氧水中臭氧的溶解和衰减特性；研究微/纳米气泡臭氧水对供试真菌—尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌的杀灭效果；对温室土壤浇灌微/纳米气泡臭氧水，研究微/纳米气泡臭氧水对土壤中致病性尖孢镰刀菌的杀灭效果，以期为采用微/纳米气泡臭氧水对土壤中尖孢镰刀菌的杀灭效果提供数据和技术支持。
1 材料与方法
试验分别于2012年5月—2013年2月和2014年2—6月在中国农业大学水利与土木工程学院农业部设施农业工程重点实验室进行。试验装置主要包括臭氧发生器、微/纳米气泡发生器、氧气罐以及无菌操作台等。试验用水采用实验室自来水，pH=7.4。营养土购买于北京市海淀区通厦花卉市场。
1.1 试验装置
试验装置如图1，臭氧发生器与微/纳米气泡发生器相连，氧气罐为臭氧发生器提供气源，通过水冷方式为臭氧发生器降温；微/纳米气泡发生器主要包括气液混合泵和微/纳米气泡曝气头。气液混合泵将储液桶（容积为35L，取水量为20L）中的自来水，与臭氧发生器产生的臭氧进行混合，然后气液混合体在曝气头中以22500—45250rpm 的速度高速旋回，将臭氧切分为直径5—30nm的气泡，形成微/纳米气泡臭氧水。试验所用臭氧发生器（GQ-TGI为天津水产研究所研制，属搪瓷单管式水冷臭氧发生器，臭氧产量为25g·h-1；微/纳米气泡发生器（定制）为本洲（北京）纳米科技有限公司生产，处理水量2—3m3·h-1，功率0.37kW。
1.2 供试真菌
番茄枯萎病病原菌—尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici），由中国农业大学农学与生物技术学院植物病理系实验室提供。在无菌操作下，取病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基上，放置于150r·min-1、28℃恒温摇床上培养5~7d 。待产生大量孢子后，取培养物在漩涡震荡仪上震荡数分钟，以分散培养物，使其成为均匀的悬液，用4 层无菌纱布过滤以除去菌丝，滤液即为孢子悬液[29]。感染土壤用的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）购买于中国科学院菌种保藏中心。
1.3 方法
1.3.1 微/纳米气泡臭氧水中臭氧的溶解与衰减规律
（1)曝气开始前，调节水温为20±1℃；（2)曝气达到预设时间点时，按照碘量法测定水中的臭氧浓度；（3)曝气结束后，每隔5min测定1次水中的臭氧浓度，待浓度衰减变慢后，每隔10min或15min测定1 次臭氧浓度，半衰期之后，每隔30min或45min测定1次臭氧浓度。
1.3.2 微/纳米气泡臭氧水对尖孢镰刀菌孢子的杀灭
试验（1)将孢子悬液置于高倍显微镜下，利用血球计数板进行计数，然后将其稀释成104数量级的孢子悬液，体积为15L；（2)取1 组空白样品，包含3个重复，作为试验对照组CK；（3)将曝气头放入配制好的孢子悬液中，开启试验装置，向其中通入臭氧，按设定曝气的时间点：1，2，4，6min分别取样，每组样品包含3个重复；（4)取样后立即用移液枪取0.5mL 样品，注入事先准备好的、含4.5mL中和试剂的试管中，摇匀。每次取样（包括空白取样）时，同时采用碘量法进行滴定，以确定对应时间点孢子悬液中臭氧的浓度；（5)取样结束后，在超净工作台中，选择适当的稀释度涂于马铃薯葡萄糖琼脂平板上，每个稀释度做3 个平行，然后置于28℃恒温箱中倒置培养，培养3d 后计数。以对照组CK长出的菌落数为起始菌落数，根据下式进行杀灭率的计算：
1.3.3 微/纳米气泡臭氧水对土壤中致病性尖孢镰刀菌杀灭的模拟试验
（1)刮取保藏于斜面培养基的致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），在无菌条件下接种至配好的PDA 固体培养基（马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水1000mL，煮沸30min，纱布过滤，再加20g 葡萄糖，15g琼脂，121℃灭菌30min，趁热倒平板，冷却备用。）放置在28℃恒温培养箱内培养3d后，转移到PDA液体培养基中，在150r·min-1、28℃恒温摇床上产孢，培养4d后过滤，用血球计数板进行计数，将较高浓度的孢子悬浮液稀释到3L后作为喷洒液，用喷壶均匀洒在营养土里，待菌在营养土中适应3d后，用该营养土模拟被致病性尖孢镰刀菌感染的病土。（2)在9个大小为194×284×142mm (W×L×H) 的容器中，分别装入等量的病土1700g，容器底部有6个排水孔，1个空白，2个处理，各3个重复；（3)从9个容器中分别准确取15g土壤，取样深度为2.5cm，溶于100mL 0.7‰灭菌琼脂水中，采用文献中的选择培养方法对病土中致病性尖孢镰刀菌个数进行测定以确定初始菌量，同时，从9个容器中分别称取20g的土壤烘干后测其含水量（以每克干土含菌量进行计算以保证实验结果精确性）。（4)将微/纳米气泡臭氧通入15L自来水中，分别制备臭氧浓度为1.2~1.7，7.8~ 8.3 mg·L-1的微/纳米气泡臭氧水，同时取以上2种浓度臭氧水750mL 分别浇灌于6个病土中，并以未曝气的等量自来水作为对照CK；处理完的72h后，采用同样的方法测各病土中尖孢镰刀菌的含量。（5)在第1次通入臭氧水灭菌试验结束7d和14d后，对上述土壤样品，采用同样的方法，分别进行第2次、第3次灭菌试验。杀菌率同样按照公式1计算。
2 结果与分析
2.1 微/纳米气泡臭氧水中臭氧的溶解与衰减规律
2.1.1 微/纳米气泡臭氧水中臭氧的溶解规律
在进气量0.4L.min-1、水温20℃、自来水pH=7.4、EC=0.48mS·cm-1的试验条件下，检测微/纳米气泡臭氧水中臭氧浓度随曝气时间的变化规律（图2）。由图2可知，微/纳米气泡臭氧水中臭氧浓度随曝气时间的延长不断上升，但上升速度逐渐减缓，直至稳定。曝气0~1min内，臭氧浓度增加较快，1min时臭氧浓度达到1.8mg·L-1；曝气1~4min 是臭氧浓度增加最快的阶段，臭氧浓度在3min内增加9.4mg·L-1；曝气4min后浓度上升速度减缓，最终浓度稳定在11.0mg·L-1。对数据进行回归分析，得到溶解曲线的回归方程为：y=-0.21x2+3.204x-0.451,R2=0.984。因此，曝气1~4min是微/纳米气泡臭氧水中臭氧溶解最关键的时间段。
2.1.2 微/纳米气泡臭氧水中臭氧的衰减规律
在进气量为0.4L·min-1、水温20℃、自来水pH=7.4、EC=0.48mS·cm-1 的试验条件下，检测微/纳米气泡臭氧水中臭氧的衰减规律（图3）。由图3 可知，曝气结束初期，臭氧浓度衰减速度较快，半衰期在20min；停止曝气1h 后，臭氧浓度又衰减50%；之后衰减速率变缓，臭氧浓度较长时间（大于3h）稳定在1.3mg·L-1。对数据进行回归分析，臭氧衰减曲线的回归方程为：y=-1.92ln（x）+10.77,R2=0.98。因此，停止曝气后的60min内（若对臭氧浓度要求较高，则是20min内），是用于灭菌的主要时间段。
2.2 微/纳米气泡臭氧水对目标真菌（尖孢镰刀菌）的杀灭试验
在水温16.2℃，进气量0.4 L·min-1的试验条件下，采用微/纳米气泡装置曝气0.5,1,2,4min，测得制备的臭氧水浓度分别为0.9,3.1,7.3,12.3 mg·L-1，利用这4种不同浓度的微/纳米气泡臭氧水对尖孢镰刀菌进行灭菌试验（图4）。
由图4可知，曝气时间为0.5min、孢子悬液中臭氧浓度为0.9 mg·L-1时，对尖孢镰刀菌的杀灭率平均已达96%；在曝气时间为1min、孢子悬液中臭氧浓度为3.1mg·L-1时，杀菌率达到99%；曝气时间为2min 和4min，孢子悬液中的臭氧浓度分别达到7.3mg·L-1 和12.3mg·L-1，对浓度为2.4×104个·mL-1 的尖孢镰刀菌孢子悬液的杀灭率均达到100%。由此可以看出，微/纳米气泡臭氧水对浓度为104个·mL-1数量级的尖孢镰刀菌杀灭效果十分显著。
2.3 微/纳米气泡臭氧水对土壤中致病性尖孢镰刀菌杀灭的模拟试验
在水温21℃、进气量0.4L·min-1 的试验条件下，采用微/纳米气泡发生装置曝气0.5min和3min，制备的微/纳米气泡臭氧水浓度分别为1.2~1.7mg·L-1 和7.8~8.3mg·L-1。利用这2种臭氧水进行土壤中尖孢镰刀菌的杀灭试验（图5、图6）。
由图5可知，将1L菌原液稀释到3L后的尖孢镰刀菌孢子悬浮液均匀感染到土中，待尖孢镰刀菌适应土壤环境后随机分装到9个盒子中，测得的初始菌量约为4×104个·g-1干土。第1次处理后，第3天测得经1.2~1.7mg·L-1 臭氧水、7.8~8.3mg·L-1 臭氧水和对照自来水处理的土壤中尖孢镰刀菌含量均有所下降，用臭氧水作为处理的土壤中菌的含量下降明显，因为尖孢镰刀菌是一种好氧型真菌，加入水后会使土壤通气性变差，导致部分菌的死亡，同时臭氧水又有较高的氧化性；处理后，尖孢镰刀菌在土里繁殖生长，1.2~1.7mg·L-1臭氧水处理的土壤中菌上升较快。第7天进行第2次处理，7~10d，用自来水处理的土壤中菌含量继续上升，臭氧水处理的土壤菌量下降，7.8~8.3mg·L-1 的高浓度臭氧水处理的土壤菌量下降迅速且上升缓慢。第14天进行第3次处理，自来水处理的土壤菌含量继续上升，臭氧水处理的土壤中菌被杀死后继续繁殖生长。
综上，土壤通气性影响土壤中尖孢镰刀菌的生长，臭氧水的氧化性对土壤中的尖孢镰刀菌具有一定的杀灭作用和抑制其生长繁殖的作用，且7.8~8.3mg·L-1的高浓度臭氧水由于其较强的氧化性杀灭效果更为显著。
由图6可知，当微/纳米气泡臭氧水中的臭氧浓度为1.2~1.7mg·L-1时，对致病性尖孢镰刀菌的三次杀灭率分别为41.67%、62.33%、76.83%；当臭氧浓度达到7.8~8.3mg·L-1时，对致病性尖孢镰刀菌的三次杀灭率分别为45.20%、82.14%、88.76%，在试验的浓度范围内，臭氧水中的臭氧浓度越高，杀灭效果越好。在间隔7d的3次连续灭菌处理后，臭氧浓度为1.2~1.7 mg·L-1时，杀灭率为76.83%，当臭氧浓度达到7.8~8.3mg·L-1时，杀灭率为88.76%，说明臭氧对于土传病害的典型真菌尖孢镰刀菌具有很好的杀灭和抑制作用。
3 讨论
臭氧以微/纳米气泡形式溶解于水中，相对于普通直接曝气方式，其溶解度有很大提高。在微/纳米气泡发生器的进气流量为0.4L·min-1、水温20℃、自来水pH=7.4、EC=0.48mS·cm-1的条件下，检测发现：在曝气1—4min时间段内臭氧浓度增加得最快，增加9.4mg·L-1，占最终浓度的87%。同样条件下的臭氧衰减试验表明，臭氧浓度的半衰期为20min；停止曝气1h后，臭氧浓度又衰减50%。之后衰减速率变缓， 最终能较长时间地稳定在1.3mg·L-1。因此，微/纳米气泡臭氧水中的臭氧溶解度很高，并且很稳定。在实验室内用微/纳米臭氧水处理2.4×104 个·mL-1的尖孢镰刀菌番茄专化型病原菌孢子悬液，当臭氧浓度为0.9mg·L-1、接触时间0.5min时, 臭氧对病原菌孢子的杀灭率平均已达96%；在臭氧浓度为7.3mg·L-1、接触时间2min时, 灭菌率达到100%，灭菌速率和效率都很高。通过杀菌试验可以发现，对于一定浓度的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，很低浓度（约1 mg·L-1）的臭氧水就能达到很好的杀菌效果，杀菌率能达95%以上。从模拟杀灭土壤中致病性尖孢镰刀菌的试验中发现，高浓度（7.8~8.3mg·L-1）的臭氧水处理时，杀灭率接近90%，土壤消毒效果显著。当臭氧浓度为1.2~1.7mg·L-1的臭氧水对土壤中尖孢镰刀菌的杀灭率只有76%。这说明土壤的复杂性要求更高浓度的臭氧水才能达到较好的灭菌效果。因此，微/纳米气泡臭氧水具有的臭氧溶解度高且稳定性好的特性，对于采用臭氧水进行土壤消毒意义重大。
本研究结果表明，用微/纳米气泡臭氧水处理土传病害中的典型真菌尖孢镰刀菌孢子悬浮液，在较低浓度（1mg·L-1）时接触很短时间（0.5min）就有较高的杀灭率（96%）；在较高浓度（7.3mg·L-1）时接触2min 即可达到100%的杀灭效果。模拟土壤进行多次灭菌，在使用浓度为1.2~1.7mg·L-1的微/纳米气泡臭氧水，经过3次灭菌后，对尖孢镰刀菌的杀灭率可达到76.83%。当采用较高的臭氧浓度、多次灭菌时，如臭氧浓度7.8~8.3mg·L-1，对真菌的杀灭率可达88.76%，已经达到较好的土壤消毒效果。
因此，采用适当的臭氧浓度和适宜的灭菌制度，利用微/纳米气泡臭氧水进行温室的土壤消毒是可行的。当然，多次灭菌之间的间隔时间、臭氧水的浓度以及臭氧水消毒对土壤的理化性质和肥力的影响等，有待进一步的试验研究。
来源：《沈阳学业大学学报》